PCR 实验前

就这？这么简单的实验姐分分钟做完

做 PCR 实验中

姐就是女王，自信放光芒

电泳跑胶后

嗯？怎么什么条带都没有！除了 marker 还是 marker！

分析原因中

大意了！一定是有什么东西忘加了

再次 PCR 实验中

模板、引物、DNA 聚合酶、水，这回没错了！

电泳跑胶后

一整个大无语，跑胶还是没条带！实验女王重演翻车现场！

模板降解

1. 尽量选择新鲜提取的模板进行 PCR 扩增，通过凝胶电泳检测模板的完整性，若降解严重需要重新制备模板；

2. 模板避免反复冻融。

模板中含有DNA聚合酶活性抑制剂

1. 采用离心柱法提取核酸，纯化模板，消除抑制剂的干扰；

2. 适当减少模板量，采用梯度稀释摸索最佳模板量；

3. 选用抗逆性强的 DNA 聚合酶。

模板量太低

1. 适当增加模板量；

2. 模板为 cDNA 时，选用目的基因表达量高的组织提取高质量 RNA 并选用基因克隆专用的反转录试剂盒得到的 cDNA 作为模板；

3. 选用灵敏度高的 DNA 聚合酶。

高GC，复杂模板

1. 使用 PCR 添加剂（比如 DMSO，甜菜碱）或 GC enhancer，促进高 GC，复杂序列模板双链解离从而有利于引物退火和序列延伸；

2. 增加变性时间或温度，使 DNA 双链彻底解离；

3. 选用适用于高 GC，复杂模板扩增的 DNA 聚合酶。

长片段

1. 确保模板的完整性；

2. 选择适用于长片段扩增的 Taq DNA 聚合酶或者超强高保真 DNA 聚合酶；

3. 在试剂盒说明书建议的延伸速度基础上适当延长延伸时间；

4. 采用抑制热交错 PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）策略。

引物降解

1. 重新合成高质量引物，少量分装保存，防止多次冻融，避免长期置于冰箱冷藏部分。

引物设计不合理

1. 建议使用引物设计软件（比如 Primer premier 6, Oligo 7 等）设计并选取评分较高的引物；

2. 确保引物和模板结合的特异性。

DNA聚合酶选择不合适

1. 根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶，比如分子克隆实验中涉及到序列的高保真扩增，需要选择一款针对不同类型序列具有普适性的高保真酶。

DNA聚合酶活力下降

1. 检查试剂是否过期，按照说明书要求合理保存试剂。

反应缓冲液体系与目的基因不匹配

1. 不同目的 PCR 反应要求反应缓冲液中的镁离子、钾离子、铵离子、化学添加剂等成分浓度是不一样的，建议使用试剂盒中优化好的缓冲液体系。

退火温度不合适

1. 使用引物设计软件建议的退火温度，退火温度一般比引物的 Tm 值低 5 ℃；

2. 不同的试剂盐离子浓度不同，最佳的退火温度可能存在差异，建议以软件建议退火温度为中心设置温度梯度，来获得最佳退火温度；

3. 设置降落 PCR（Step-down）反应程序。

其他反应条件不合适

1. 不同的 DNA 聚合酶试剂最佳反应条件是有差别的，选用试剂说明书建议的变性温度和时间，退火时间，延伸温度和速度，循环数。